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南京肽業(yè)YM說多肽|糖肽合成專題——復(fù)雜糖基化氨基酸的保護、偶聯(lián)與立體化學(xué)博弈

南京肽業(yè)YM說多肽 

糖肽合成專題

復(fù)雜糖基化氨基酸的保護、偶聯(lián)與立體化學(xué)博弈

核心要義： 糖肽合成是多肽化學(xué)中復(fù)雜度最高的前沿領(lǐng)域之一，它要求在精確控制多肽序列的同時，將結(jié)構(gòu)復(fù)雜、高度功能化的糖鏈以特定糖苷鍵（α/β構(gòu)型）連接到特定氨基酸側(cè)鏈（通常是Ser/Thr/Asn）。這不僅是對保護基正交性藝術(shù)的極致考驗，更是對糖化學(xué)與肽化學(xué)融合的挑戰(zhàn)。

一、 糖肽的生物學(xué)意義與合成挑戰(zhàn)

1. 為何重要？ 蛋白質(zhì)糖基化是最重要、最復(fù)雜的翻譯后修飾之一，深刻影響蛋白質(zhì)的折疊、穩(wěn)定性、免疫原性、細胞識別與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。合成結(jié)構(gòu)均一的糖肽是研究這些功能的基礎(chǔ)工具，也是開發(fā)糖蛋白藥物和疫苗的關(guān)鍵。

2. 核心合成挑戰(zhàn)：

   • 糖基的敏感性： 糖環(huán)上的眾多羥基和糖苷鍵對強酸、強堿、某些金屬離子和還原劑敏感，這與多肽合成所需的劇烈條件（如TFA切割、哌啶脫Fmoc）存在根本沖突。

   • 正交性要求的極端化： 需要設(shè)計能在多肽合成全過程中穩(wěn)定存在，最后又能被選擇性、溫和脫除的糖基保護基。

   • 糖苷鍵構(gòu)建的立體選擇性： 無論是N-連接（Asn）還是O-連接（Ser/Thr），形成糖苷鍵時都必須嚴格控制其立體構(gòu)型（α或β），這需要精妙的糖基供體設(shè)計和活化策略。

   • 溶解性問題： 高度糖基化的肽段親水性極強，在固相合成常用的有機溶劑（如DMF， DCM）中溶解性和樹脂溶脹性差，導(dǎo)致偶聯(lián)效率低下。

二、 糖基化氨基酸構(gòu)建單元：設(shè)計與合成

這是糖肽合成的基石。策略主要分為“預(yù)組裝糖氨基酸”和“后糖基化”兩條路徑。

1. 預(yù)組裝糖氨基酸策略

• 概念： 在溶液相中，預(yù)先將帶有全保護糖基的糖鏈連接到適當(dāng)保護的氨基酸側(cè)鏈上，形成一個結(jié)構(gòu)明確的“糖基化-氨基酸”單體（如Fmoc-Ser[Ac?-β-D-GlcNAc]-OH）。

• 優(yōu)勢：

  • 結(jié)構(gòu)明確： 糖苷鍵的構(gòu)型在單體階段就已通過經(jīng)典的糖化學(xué)方法精確控制并得到表征。

  • 固相合成簡便： 該單體可像普通保護氨基酸一樣直接用于Fmoc-SPPS，簡化了在樹脂上進行復(fù)雜糖化學(xué)的操作。

• 挑戰(zhàn)：

  • 單體合成極具挑戰(zhàn)： 需要多步有機合成，涉及復(fù)雜的糖基保護/去保護，總產(chǎn)率低，是主要瓶頸。

  • 靈活性差： 一旦單體合成，糖鏈結(jié)構(gòu)即固定，難以在肽鏈上對糖鏈進行后續(xù)修飾或延伸。

2. 糖基化氨基酸單體的保護基設(shè)計
糖環(huán)上的羥基通常采用兩類保護基，其選擇取決于多肽合成策略：

• 酯類保護基（如乙?；?Ac， 氯乙?；?ClAc）：

  • 穩(wěn)定性： 對堿不穩(wěn)定，但對酸穩(wěn)定。

  • 應(yīng)用場景： 主要用于 Boc-SPPS策略。因為Boc策略的最終脫保護是強酸（HF或TFMSA），酯基在此條件下穩(wěn)定，可在最后一步與側(cè)鏈保護基一同脫除。但與Fmoc-SPPS不兼容，因為Fmoc脫保護所用的哌啶堿會脫除酯基。

• 醚類保護基（如芐基 Bn， 對甲氧基芐基 PMB）：

  • 穩(wěn)定性： 對堿穩(wěn)定，但對酸不穩(wěn)定（或可通過氫化脫除）。

  • 應(yīng)用場景： 主要用于 Fmoc-SPPS策略。在哌啶脫Fmoc時穩(wěn)定，最終用TFA切割時，可與肽鏈的tBu等側(cè)鏈保護基一同脫除。部分芐基可能需要額外使用氫化或路易斯酸條件脫除。

三、 固相糖肽合成核心策略

策略A：線性Fmoc-SPPS使用預(yù)組裝單體
這是目前最主流、最可靠的方法。

1. 流程： 直接使用Fmoc保護的、糖基為芐醚類保護（如Bn）的糖氨基酸單體進行標準偶聯(lián)。

2. 關(guān)鍵： 確保單體在偶聯(lián)和多次哌啶處理下穩(wěn)定。脫保護后，最終用強酸TFA切割，一步脫除所有側(cè)鏈保護基和糖基的芐醚保護。若糖基上有對酸敏感的特殊保護基（如乙?；?，則需在切割后進行額外的溫和堿處理（如氨甲醇）。

3. 優(yōu)點： 操作標準化，易于自動化，適用于合成O-連接糖肽和含有核心五糖（如Man?GlcNAc?）的N-連接糖肽。

策略B：固相上的糖鏈延伸
對于更復(fù)雜的分支寡糖鏈，常采用匯聚與線性結(jié)合的策略。

1. 在樹脂上引入糖基化“起點”： 先通過預(yù)組裝單體引入第一個糖（如與Ser/Thr相連的GalNAc，或與Asn相連的GlcNAc）。

2. 選擇性脫除糖基上的臨時保護基： 在樹脂上，選擇性地脫去糖基特定位置（如C-3， C-6）的臨時保護基（如乙?；⒙纫阴；?，暴露出游離羥基。

3. 糖基化反應(yīng)： 使用活化好的糖基供體（如糖基三氯乙酰亞胺酯，即“施密特糖苷化試劑”）在樹脂上與暴露的羥基反應(yīng)，延伸糖鏈。此步驟對立體選擇性控制要求極高。

4. 迭代： 重復(fù)“選擇性去保護-糖基化”循環(huán)，逐步構(gòu)建復(fù)雜寡糖。這要求每一步的化學(xué)反應(yīng)都與固相載體兼容，且產(chǎn)率足夠高。

四、 正交保護與“正交去保護糖基化”

這是合成多位點、異質(zhì)糖基化糖肽的尖端技術(shù)。

• 概念： 在同一個糖肽的不同位點引入帶有不同保護基的相同糖基（例如，一個位點用對光不穩(wěn)定的保護基，另一位點用對氟離子不穩(wěn)定的保護基）。在合成完成后，通過不同刺激（光、氟離子）選擇性地移除特定糖基上的保護，從而允許對該位點的糖鏈進行差異化后修飾。

• 示例： 一個糖肽的兩個蘇氨酸上各連接了一個全保護的半乳糖。其中一個半乳糖的C-6羥基被光不穩(wěn)定的硝基芐基保護，另一個則被叔丁基二苯基硅基保護。合成后，先用光照脫除硝基芐基，暴露出一個C-6羥基，可將其磺酸化；隨后用氟化物脫除TBDPS，暴露出另一個C-6羥基，可將其連接另一個糖。這就實現(xiàn)了對同一糖肽上不同位點糖鏈的精準編輯。

五、 合成后折疊與功能

化學(xué)合成的糖肽是線性或部分折疊的，其生物學(xué)功能依賴于正確的三維結(jié)構(gòu)。

1. 糖基化引導(dǎo)折疊： 糖鏈的巨大親水性和空間位阻能強烈影響多肽的局部構(gòu)象和整體折疊路徑。例如，特定的N-連接糖鏈可作為“內(nèi)部分子伴侶”，輔助蛋白質(zhì)的正確折疊。

2. 折疊驗證： 需要通過圓二色譜、核磁共振等技術(shù)驗證合成糖肽的二級和三級結(jié)構(gòu)是否與天然糖蛋白結(jié)構(gòu)域一致。

六、 應(yīng)用與前沿

1. 糖疫苗開發(fā)： 合成腫瘤相關(guān)糖抗原與載體蛋白的多肽表位連接物，用于激發(fā)特異性免疫反應(yīng)。

2. 糖蛋白相互作用研究： 合成結(jié)構(gòu)精確的糖肽，用于篩選與凝集素、抗體或病毒刺突蛋白（如SARS-CoV-2的S蛋白）的結(jié)合，闡明糖鏈在識別中的精確作用。

3. 酶底物與抑制劑： 合成糖基轉(zhuǎn)移酶或糖苷酶的底物/抑制劑，研究其機制或用于藥物開發(fā)。

4. 均相糖蛋白藥物的化學(xué)合成： 通過天然化學(xué)連接等技術(shù)，將合成的糖肽片段與大的蛋白片段連接，獲得結(jié)構(gòu)完全均一的全合成糖蛋白（如合成促紅細胞生成素EPO的活性結(jié)構(gòu)域）。

總結(jié)：
糖肽合成是站在多肽化學(xué)和糖化學(xué)兩個巨人肩膀上的學(xué)科。它迫使化學(xué)家發(fā)展出最精巧的保護基策略，以調(diào)和兩個領(lǐng)域?qū)Ψ磻?yīng)條件的苛刻且矛盾的要求。無論是采用預(yù)組裝的“聰明單體”，還是勇于在固相上進行糖鏈延伸的“化學(xué)雕塑”，其目標都是獲得那把結(jié)構(gòu)精準的“鑰匙”——用于解鎖糖基化在生命科學(xué)中深藏的奧秘。隨著化學(xué)酶法合成、自動化平臺和人工智能輔助設(shè)計的發(fā)展，這一領(lǐng)域正從一門藝術(shù)逐漸走向可預(yù)測和規(guī)?；瑸樘强茖W(xué)和糖藥物時代奠定堅實的物質(zhì)基礎(chǔ)。