DOI: 10.16155/j.0254-1793.2017.01.01

基于機器學(xué)習(xí)及外部“探針”策略的HPLC保留時間預(yù)測的研究

來源：藥物分析雜志 2019, Vol. 39 Issue (4): 716-721. DOI: 10.16155/j.0254-1793.2019.04.18

石巖 , 熊婧 , 魏鋒 , 馬雙成    

摘要：目的：研究并建立徑向基函數(shù)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測化合物色譜峰HPLC保留時間的方法。方法：使用Agilent TC-C₁₈色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm），甲醇-水為流動相等度洗脫，以毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、山柰苷、山柰素、槲皮素、刺芒柄花苷、毛蕊異黃酮及異鼠李素8個化合物為研究對象，不同比例流動相洗脫條件下其中7個化合物色譜峰保留時間為特征，與待預(yù)測化合物色譜峰保留時間組成訓(xùn)練集各樣本，生成并訓(xùn)練神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，使得該神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)具有通過以上7個化合物色譜峰保留時間預(yù)測待預(yù)測化合物色譜峰保留時間的能力。結(jié)果：在使用同一型號色譜柱不同HPLC儀器的情況下，模型的保留時間預(yù)測誤差不大于0.608 min。結(jié)論：本研究創(chuàng)建的方法能夠?qū)衔锉Ａ魰r間進(jìn)行有效和準(zhǔn)確地預(yù)測。

在液相色譜分析中，對比色譜峰的保留時間（retention time，RT）是非常重要的定性手段。一般情況下，不同的化合物在相同的HPLC洗脫系統(tǒng)中的色譜峰往往具有不同RT，而同一化合物在不同的HPLC洗脫系統(tǒng)中的色譜峰RT一般也不相同，因此常常需要使用對照物質(zhì)（對照品或?qū)φ仗崛∥铮﹣泶_定待分析化合物的色譜峰在HPLC系統(tǒng)中的RT。然而，隨著中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的不斷發(fā)展，以及多組分和整體模式評價方法的日益增多，對照物質(zhì)的制備、標(biāo)定、儲存等環(huán)節(jié)都面臨著挑戰(zhàn)^[1]，對照物質(zhì)在檢測成本中的比重也越來越大。為了解決這一問題，一些化合物色譜峰RT預(yù)測及確定的方法應(yīng)運而生，主要有相對保留時間法^[2]、雙標(biāo)線性校正法^[3]和定量結(jié)構(gòu)性質(zhì)關(guān)系（quantitative structure property relationship，QSPR）法^[4-6]等。本文利用機器學(xué)習(xí)中徑向基函數(shù)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（radial basis function neural network，RBFNN）的方法，對化合物色譜峰的RT進(jìn)行預(yù)測研究，在建模和預(yù)測過程中，創(chuàng)新地加入了猶如“探針”般探測表征色譜洗脫條件的其他幾個化合物，能夠準(zhǔn)確地預(yù)測多個化合物在不同等度洗脫條件下的RT。

機器學(xué)習(xí)領(lǐng)域的前驅(qū)Arthur Samuel將機器學(xué)習(xí)歸結(jié)為研究賦予計算機學(xué)習(xí)能力而并非直接編寫程序的領(lǐng)域。而Tom Mitchell在《Machine Learning》一書中，對機器學(xué)習(xí)進(jìn)行了更加詳細(xì)地描述：計算機程序在完成以性能度量P衡量的目標(biāo)T過程中，如果在經(jīng)驗E的影響下，對P衡量的T結(jié)果有所改進(jìn)，那么該程序就是依據(jù)E在學(xué)習(xí)^[7]。圖 1展示了機器學(xué)習(xí)的一個整體過程，一般來說，首先需要將已有的數(shù)據(jù)放入訓(xùn)練集（training set，TS），然后通過某些算法來實現(xiàn)計算機對TS的學(xué)習(xí)。在學(xué)習(xí)過程中，計算機需要不斷調(diào)整算法參數(shù)，以達(dá)到預(yù)測結(jié)果距離目標(biāo)值最接近。機器學(xué)習(xí)的結(jié)果可達(dá)到相對最優(yōu)的算法參數(shù)，作為假想（hypothesis）以實現(xiàn)根據(jù)對未知樣品的特征（feature）進(jìn)行目標(biāo)的預(yù)測判斷。TS如圖 2所示，一般需要包含m個已知樣品，分別用n個特征表示，每個樣品都有相應(yīng)輸出目標(biāo)。

圖 1 機器學(xué)習(xí)概況圖Fig.1 General picture of machine learning

圖 2 TS組成Fig.2 Form of TS

本研究的思路是計算機通過對m個HPLC條件n個化合物色譜峰RT及其對應(yīng)的待預(yù)測化合物色譜峰RT進(jìn)行學(xué)習(xí)，獲得相對最優(yōu)化學(xué)習(xí)成果，從而實現(xiàn)不同HPLC條件下對該化合物色譜峰RT的預(yù)測。與文獻(xiàn)報道的類似方法^[4-6]不同，本文創(chuàng)新性地使用了n個其他化合物的色譜峰RT作為HPLC條件的特征放入學(xué)習(xí)算法的訓(xùn)練和預(yù)測中，這n個化合物與待預(yù)測化合物平行進(jìn)樣，猶如待預(yù)測化合物溶液體系外部的“探針”色譜洗脫條件表征，因此稱為外部“探針”。

本文中的機器學(xué)習(xí)使用的是RBFNN，該網(wǎng)絡(luò)是J. Moody和C. Darken于20世紀(jì)80年代提出的，是一種含單隱層的3層前饋式網(wǎng)絡(luò)（如圖 3），該網(wǎng)絡(luò)的原理及相關(guān)實驗均表明，通過基函數(shù)的運用，其可以任意精度逼近任意函數(shù)，還可以辨識非線性系統(tǒng)^[8]。RBFNN的3層分別為輸入層、隱藏層和輸出層，其中隱藏層中使用了非線性函數(shù)，對輸入層信息進(jìn)行非線性轉(zhuǎn)換至多維隱藏空間中^[9]，隱藏層中的基函數(shù)最常用的為Gaussian函數(shù)。

圖 3 RBFNN結(jié)構(gòu)圖Fig.3 RBFNN structure

本研究具體是在多種等度洗脫條件下獲得8個化合物的RT數(shù)據(jù)，分別將其中1個化合物RT作為目標(biāo)輸出，另外7個化合物RT數(shù)據(jù)作為輸入特征進(jìn)行模型訓(xùn)練，然后通過某等度洗脫條件下7個化合物的RT數(shù)據(jù)便可預(yù)測出另外的1個化合物的RT，因此本研究為了對應(yīng)8個化合物的RT預(yù)測，共建立了8個預(yù)測模型。

Waters高效液相色譜儀3臺（編號分別為H1、H2、H3），其中H1（購于2008年）為Waters 2695分離模塊，H2（購于2013年）為Waters e2695分離模塊，H1和H2均配有Waters e2998 PDA檢測器，H3（購于2004年）為Waters 2695，分離模塊配以Waters 2996 PDA檢測器。

色譜柱4根（編號分別為C1、C2、C3、C4），均為250 mm×4.6 mm規(guī)格，5 μm填料，C1（LN：MP07570002）和C2（LN：MP07570001）均為Agilent TC-C₁₈，C3為Inertsil ODS-3，C4為Phenomenex Luna C₁₈。

毛蕊異黃酮葡萄糖苷（批號111920-201505，純度97.1%）、芒柄花素（批號111703-201504，供含量測定用）、山柰苷（批號111775-200701，供含量測定用）、山柰素（批號110861-201611，純度95.5%）、槲皮素（批號100081-200406，供含量測定用）均來自中國食品藥品檢定研究院。刺芒柄花苷（批號R04J6F2，純度98%）、毛蕊異黃酮（批號P29M6R2，純度98%）及異鼠李素（批號P08J7F15965，純度98%）均來自上海源葉生物科技有限公司。

黃芪（蒙古黃芪，批號120974-201110）、葶藶子（播娘蒿，批號121220-201403）、側(cè)柏葉（批號121396-201402）3個對照藥材均來自中國食品藥品檢定研究院。

甲醇為色譜純（Thermo Fisher Scientific公司）；水為Millipore超純水。

取各對照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.1 mg的單標(biāo)對照品溶液。

分別取黃芪（蒙古黃芪）、葶藶子（播娘蒿）和側(cè)柏葉對照藥材粉末各約1 mg，加甲醇5 mL，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz）20 min，放冷，過濾，分別取各藥材濾液0.9 mL。取毛蕊異黃酮、山柰苷和刺芒柄花苷3種對照品溶液各0.1 mL，分別加入以上所取的0.9 mL的黃芪（蒙古黃芪）、葶藶子（播娘蒿）和側(cè)柏葉藥材溶液中，搖勻，所得溶液分別以Plus1、Plus2和Plus3表示。

進(jìn)樣量為5 μL，檢測波長為254 nm，流動相流速均為1.0 mL·min^-1。甲醇（A）-水（B）為流動相等度洗脫，A與B兩相的不同比例洗脫，各化合物色譜峰RT數(shù)值作為研究的特征值或目標(biāo)值，使用H1及C1在洗脫條件分別為65%A、62%A、60%A、57%A、55%A、52%A、50%A、47%A、45%A、42%A、40%A、37%A和35%A下測定的對照品色譜峰RT數(shù)據(jù)組成模型TS；洗脫條件61%A、51%A和44%A下測定的對照品色譜峰RT數(shù)據(jù)作為模型驗證集（validation set，VS）；洗脫條件59%A、49%A、46%A和41%A下測定的對照品色譜峰RT數(shù)據(jù)作為模型測試集（test set，TeS）；為測試模型對中藥基質(zhì)中化合物色譜峰的RT預(yù)測效果，49%A洗脫條件下，對3種中藥基質(zhì)加標(biāo)溶液中對照品色譜峰RT測定數(shù)據(jù)加入模型TeS；為測試模型對同型號不同批次色譜柱和不同HPLC儀器的預(yù)測效果，使用H2+C2組合（洗脫條件為60%A、53%A和49%A）、H3+C2組合（洗脫條件為51%A）的對照品RT測定結(jié)果數(shù)據(jù)加入模型TeS；為了測試模型對不同品牌色譜柱的預(yù)測能力，在49%A洗脫條件下使用H1+C3組合、H1+C4組合測定的對照品RT數(shù)據(jù)加入模型TeS。以上模型的TS、VS和TeS詳見表 1。

表 1 模型TS、VS和TeSTab.1 TS, VS and TeS

將TS中的RT數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理，將各對照品色譜峰RT分別與相應(yīng)對照品在35%A洗脫條件下的RT比較，預(yù)處理后的數(shù)據(jù)均分布在大于0而小于等于1的范圍。

如上所述，當(dāng)對某1個化合物色譜峰RT進(jìn)行預(yù)測時，另外7個化合物色譜峰的RT數(shù)據(jù)作為特征值輸入RBFNN模型，每個化合物色譜峰RT的預(yù)測為單獨1個模型，本研究共建立有8個模型，各模型隱藏層神經(jīng)元個數(shù)均選擇13，Spread參數(shù)選擇依據(jù)VS樣本預(yù)測情況而定，毛蕊異黃酮葡萄糖苷、山柰苷、刺芒柄花苷、毛蕊異黃酮、槲皮素、山柰素、異鼠李素及芒柄花素各化合物對應(yīng)模型所采用的Spread參數(shù)分別為1.5、1.0、1.0、1.5、0.5、1.0、0.5和1.5。

將TeS各樣本數(shù)據(jù)依次輸入各模型，可得出各化合物色譜峰RT預(yù)測數(shù)據(jù)，反歸一化處理后與測定的真實RT數(shù)據(jù)求差，結(jié)果見表 2。

表 2 預(yù)測值與測定值之差（min）Tab.2 Prediction errors

黃酮類化合物是一類重要的天然藥物化學(xué)成分，在自然界中分布甚廣。因此在本研究初始階段，首選從該類化合物入手，需要說明的是，與其他RT預(yù)測研究^[4-6]不同，本研究對化合物色譜峰的RT預(yù)測的時候，并未將化合物的分子結(jié)構(gòu)等相關(guān)信息納入研究信息范疇，所以理論上來講，本研究所創(chuàng)立的方法，無論是作為特征或是預(yù)測目標(biāo)，都同樣適合其他類別的化合物，但是本著嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膽B(tài)度，這一點需要下一步的試驗進(jìn)一步確證。

本著由簡入繁的思想，選擇簡單的甲醇和水洗脫系統(tǒng)，采用等度洗脫的方式進(jìn)行切入研究。在設(shè)計TS樣本的時候，兼顧了實用性及樣本的代表性，甲醇于流動相中的比例在65%到35%的區(qū)間，盡可能均勻地選擇了13個點作為訓(xùn)練樣本，所選擇的8個化合物色譜峰RT范圍為3.296~152.391 min，具有足夠廣的RT分布范圍，TS中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、山柰苷、刺芒柄花苷、毛蕊異黃酮、槲皮素、山柰素、異鼠李素及芒柄花素各化合物色譜峰RT范圍分別為3.296~11.634、3.785~40.522、4.154~30.610、5.048~57.155、5.070~60.773、6.530~113.671、6.965~147.024和7.937~152.391 min。同樣，為了優(yōu)化得到的Spread參數(shù)適用性更佳，在VS樣本的選取時，洗脫梯度盡可能分布更廣。

此外，值得一提的是，根據(jù)本研究理論，對梯度洗脫情況下化合物色譜峰RT預(yù)測的相關(guān)研究正在進(jìn)行中。

本研究設(shè)計的TeS共分4個部分：第1部分為使用與TS和VS完全相同的儀器（H1）與色譜柱（C1），以及對照品溶液進(jìn)樣的情況；第2部分為使用與TS和VS完全相同的儀器（H1）與色譜柱（C1），以及中藥復(fù)雜基質(zhì)提取溶液進(jìn)樣的情況；第3部分為使用與TS和VS完全不同的儀器（H2和H3）與同型號不同批次色譜柱（C2）的情況；第4部分為使用與TS和VS完全相同的儀器（H1）與不同廠家不同型號色譜柱（C3和C4）的情況。由表 2可知，TeS第4部分預(yù)測結(jié)果最差，而第1、第2和第3部分預(yù)測結(jié)果與實測值相比的誤差均在0.608 min以內(nèi)，均有良好的預(yù)測表現(xiàn)。

最大誤差值出現(xiàn)在第1部分41%甲醇洗脫條件下，此時模型對芒柄花素色譜峰RT預(yù)測誤差為0.608 min，該化合物RT實測值為71.366 min，屬于比較極端的洗脫條件，此時另外7個化合物色譜峰RT預(yù)測值大多也有較大誤差；而59%甲醇洗脫也屬于比較極端洗脫條件（實測RT范圍：3.560~11.805 min），但是預(yù)測誤差卻極?。?.001~0.093 min），可見模型預(yù)測效果有與RT成反比的趨勢，分析原因可能色譜分析時間越長，受干擾因素就會增多，從而造成偶然誤差增大，導(dǎo)致模型預(yù)測結(jié)果與實測值會出現(xiàn)的較大的差別，然而從本研究數(shù)據(jù)來看，71.366 min的色譜峰保留時間有著0.608 min的預(yù)測誤差完全可以接受。

TeS第2部分選用的中藥材黃芪、葶藶子和側(cè)柏葉（見圖 4），均是以黃酮類成分為質(zhì)控指標(biāo)性成分，并且分別為植物的根、種子和葉，足以代表大多數(shù)中藥才的藥用部位使用情況。模型對該部分TeS預(yù)測結(jié)果良好，表明本研究能夠滿足中藥等復(fù)雜基質(zhì)體系的分析要求。

1.毛蕊異黃酮（calycosin）2.山柰苷（kaempferitrin）3.刺芒柄花苷（ononin）圖 4 黃芪（Ⅰ）、葶藶子（Ⅱ）和側(cè)柏葉（Ⅲ）樣品液相色譜圖Fig.4 HPLC chromatograms of Astragali Radix (Ⅰ), Descurainiae Semen (Ⅱ) and Platycladi Cacumen (Ⅲ)

對于TeS第3部分來說，是為了考察不同柱前體積、不同儀器運行狀態(tài)和同型號不同批號色譜柱，模型適用情況而設(shè)。模型對于該部分預(yù)測結(jié)果良好，可見在指定型號色譜柱情況下，本研究建立的方法可應(yīng)用于不同儀器。通常來講，由于不同廠家不同型號的色譜柱鍵合的基團不同，色譜行為會有著較大的差異，從機器學(xué)習(xí)原理來講，TS與TeS使用色譜柱如果差別較大，預(yù)測結(jié)果也會有較大誤差，這一點也從對TeS第4部分的預(yù)測結(jié)果得到證實，可見本研究所建立的方法具有一定的色譜柱排他性。

本研究使用多個化合物作為“探針”，起到探測和表征液相色譜條件特性的目的。由于本研究起到“探針”作用的化合物成分與待預(yù)測成分并未在同一分析基質(zhì)體系內(nèi)，故為稱為外部“探針”。對于基質(zhì)對化合物色譜行為影響嚴(yán)重的情況，可以采用人為加入法，將“探針”化合物加入待預(yù)測基質(zhì)內(nèi)，即為內(nèi)部“探針”。從本研究原理上來看，內(nèi)部“探針”的選用其實應(yīng)不受基質(zhì)中原有化合物的束縛，但是關(guān)于其應(yīng)用效果有待進(jìn)一步深入研究數(shù)據(jù)的證實。

本研究應(yīng)用機器學(xué)習(xí)理論中的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的方法，從本質(zhì)上與相對保留時間等方法^[2-3]完全不同，在模型的應(yīng)用上與一些文獻(xiàn)報道的方法^[4-6]相近，但是在特征選取上有著較大的差別，本研究并未將化合物分子結(jié)構(gòu)作為模型特征，而專注于色譜條件特性的表征，創(chuàng)新地使用多種化合物（即“探針”）色譜峰的RT來表征色譜洗脫條件，具有簡便、直觀和準(zhǔn)確的特點，不僅適用于已知結(jié)構(gòu)和已知成分的色譜峰RT預(yù)測，對于未知結(jié)構(gòu)或未知成分的色譜峰RT預(yù)測也同樣適用，而且可實現(xiàn)洗脫條件在一定范圍內(nèi)的可調(diào)。

從本質(zhì)上講，本研究前期的模型建立與訓(xùn)練必不可少，在TS樣本的科學(xué)設(shè)計前提下，數(shù)據(jù)時代網(wǎng)絡(luò)化的今天給了本研究的應(yīng)用提供了契機。本研究所建立的方法可應(yīng)用于藥物分析領(lǐng)域中一測多評方法的待測成分RT定位，在規(guī)定色譜柱型號的前提下，可在一定范圍內(nèi)對供試品溶液的洗脫條件進(jìn)行優(yōu)化，直到待測成分色譜峰與其他色譜峰完全分離。本研究還可應(yīng)用于中藥特征圖譜中特征色譜峰的檢測定位，在模型建立后，只需提供“探針”化合物RT數(shù)據(jù)，便可在該洗脫條件下，精確鎖定特征圖譜中的特征峰應(yīng)出現(xiàn)的位置?？偠灾?，本研究對于價高難制備的對照物質(zhì)的替代具有極大的應(yīng)用前景，只需使用幾個價廉易得的對照物質(zhì)（或1個對照提取物）即可，對于中藥的質(zhì)量分析、評價與控制工作都極具意義。

基于機器學(xué)習(xí)及外部“探針”策略的HPLC保留時間預(yù)測的研究

來源：藥物分析雜志 2019, Vol. 39 Issue (4): 716-721. DOI: 10.16155/j.0254-1793.2019.04.18

參考文獻(xiàn)