總機：025-58361106-801
傳真：025-58361107-806
Email：info@njpeptide.com
地址：南京市化學工業(yè)園區(qū)方水路158號三樓
無菌藥品生產(chǎn)企業(yè)過程污染微生物菌株庫的建立及數(shù)據(jù)分析
藥物分析雜志 2019, Vol. 39 
Issue (11): 1954-1960. DOI: 10.16155/j.0254-1793.2019.11.05
藥品，尤其是注射液、注射用無菌粉末、眼用制劑等高風險無菌產(chǎn)品，如在生產(chǎn)、貯存過程中被微生物污染，會造成臨床患者感染甚至死亡等嚴重不良后果[1-3]。2015-2017年，美國FDA公布的藥品召回事件中，由微生物污染風險引起的召回事件占到了50%[4]，因此藥品（尤其是無菌藥品）生產(chǎn)企業(yè)能否實現(xiàn)產(chǎn)品中微生物污染的有效控制，已成為企業(yè)的生命線。藥品污染的微生物可能來源于藥品生產(chǎn)、運輸、使用等多個環(huán)節(jié)，且藥品微生物污染具有不均勻性，僅依靠對終產(chǎn)品抽樣進行無菌檢查無法確保發(fā)現(xiàn)問題。加強藥品生產(chǎn)過程的微生物控制是防止問題藥品流入市場和保障人民用藥安全的關鍵[5]?！吨腥A人民共和國藥典》2020年版編制綱要突出強調(diào)了藥品質(zhì)量全過程控制的重要性，由藥品終端控制向生產(chǎn)過程控制延伸，指出了我國藥品提高質(zhì)量和醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)升級的努力方向。
實現(xiàn)藥品生產(chǎn)過程微生物的有效控制，需要企業(yè)建立完善的污染微生物監(jiān)控方案、微生物鑒定方法及微生物數(shù)據(jù)庫[6]。目前，多數(shù)藥品生產(chǎn)企業(yè)往往僅實現(xiàn)了主要核心生產(chǎn)區(qū)域的微生物監(jiān)控和污染微生物數(shù)量的統(tǒng)計，并未對污染微生物進行種屬鑒定分析，更未建立覆蓋生產(chǎn)全過程、全環(huán)節(jié)的污染微生物數(shù)據(jù)庫。對藥品生產(chǎn)過程污染微生物的有效收集、精準鑒定、聚類分析，不僅能夠快速追溯產(chǎn)品污染微生物來源，還能夠幫助企業(yè)根據(jù)監(jiān)控污染微生物種類制定更有效的清潔消毒措施，有效降低微生物負載，并阻斷污染途徑。因此，本研究結(jié)合我國藥品監(jiān)管和企業(yè)生產(chǎn)過程微生物控制需求，通過無菌藥品生產(chǎn)企業(yè)的案例示范，建立了覆蓋藥品生產(chǎn)全過程的污染微生物數(shù)據(jù)庫，能夠為真正實現(xiàn)藥品質(zhì)量過程控制和保障藥品安全提供有力支撐。
1 儀器與試劑AB 9700型PCR擴增儀（Thermo Fisher公司）；瓊脂糖凝膠電泳儀及成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司）；MIR-254型培養(yǎng)箱（SANYO公司）；LABGARD型生物安全柜（Nuaire公司）；AB3500基因分析儀（Thermo Fisher公司）；胰酪胨大豆瓊脂平板（TSA，廣東環(huán)凱公司）；細菌基因組提取試劑盒及Premix TaqTM DNA聚合酶試劑盒（TAKARA，大連寶生物工程有限公司）。
2 實驗方法2.1 無菌藥品生產(chǎn)過程微生物監(jiān)控選取某無菌藥品生產(chǎn)企業(yè)，參照《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》（2010年版）、《中華人民共和國藥典》（簡稱《中國藥典》）（2015年版）、ISO和PDA等相關標準和規(guī)范，制定覆蓋藥品生產(chǎn)過程的微生物監(jiān)控、檢測與鑒定方案。分別對原輔料、包裝材料、生產(chǎn)人員、生產(chǎn)環(huán)境、制藥用水和藥品微生物檢測實驗室等多個環(huán)節(jié)，進行微生物監(jiān)控和檢測，監(jiān)控周期為3個月。
2.2 微生物檢測與分離藥品生產(chǎn)過程污染微生物的檢測與分離，參照《中國藥典》2015年版< 1101無菌檢查法 > < 1105非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法 > < 9202非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查指導原則 > < 9205藥品潔凈實驗室微生物監(jiān)測和控制指導原則 > 等方法進行微生物檢測。微生物陽性樣本劃線接種到TSA平板或血平板，放置在適宜條件下（需氧或厭氧條件）培養(yǎng)。菌落形態(tài)觀察后，依據(jù)平板上菌落形態(tài)特征，分別挑取不同特征菌落劃線接種到TSA平板，用于菌種鑒定。
2.3 污染微生物的鑒定與分析將分離純化菌株接種到TSB液體培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)。采用細菌基因組提取試劑盒，進行基因組DNA的提取，使用16S rRNA基因通用引物27F（5’-AGTTTGATCMTGGCTC AG-3’）和1492R（5’-GGTTAC CTTGTTACGACTT-3’）進行PCR擴增。瓊脂糖凝膠電泳后，將PCR陽性擴增產(chǎn)物進行雙向測序。利用軟件Lasergene 7.0校正和拼接核酸序列[7]，然后進行16S rRNA序列的Blast比對分析，依據(jù)比對結(jié)果進行菌種判定（同源性 > 98.65%判定為同一菌種[8]）。同時采用VITEK生化鑒定系統(tǒng)及MALDITOF MS質(zhì)譜方法，對部分結(jié)果可疑的菌種進一步鑒定，基于微生物多相分類鑒定信息，判定微生物種屬信息。
3 結(jié)果分析3.1 生產(chǎn)過程不同監(jiān)控項目微生物污染分析從無菌藥品生產(chǎn)過程分離純化292株微生物，污染微生物在不同監(jiān)控項目中的分布如表 1所示。除包裝材料和微生物檢驗實驗室沒有監(jiān)測到微生物外，其余監(jiān)控項目均有微生物污染。其中生產(chǎn)環(huán)境分離微生物最多，達到212株，占全部污染微生物的72.6%；其次是生產(chǎn)用水（13.4%）、原輔料（10.3%）、生產(chǎn)人員（3.77%）。不同潔凈級別生產(chǎn)環(huán)境中，C級潔凈區(qū)微生物分離率最高（38%），值得關注的是A級潔凈區(qū)域也分離出30株微生物。
|
表 1 不同監(jiān)控項目微生物污染情況Tab.1 Microbial contamination analysis of different monitoring items |
基于多相鑒定分析，對藥品生產(chǎn)過程分離的292株微生物進行鑒定。鑒定后結(jié)合菌株分離背景，剔除可能重復分離株，最后共獲得241株微生物。菌株鑒定結(jié)果表明，241株微生物分布于44個屬，95個種（表 2、3），藥品生產(chǎn)過程污染的微生物種類非常豐富。其中，葡萄球菌污染率最高，占全部污染微生物的40.25%；其次是微球菌（11.20%）、芽孢桿菌（8.30%）和不動桿菌（5.81%）。微生物種水平鑒定結(jié)果分析表明，科氏葡萄球菌是藥品生產(chǎn)過程污染率最高的菌種，占全部污染微生物的13.69%，其次是表皮葡萄球菌（11.20%）、燦爛類芽孢桿菌（4.15%）和人葡萄球菌（4.15%）。
|
|
表 2 藥品生產(chǎn)過程污染微生物屬水平鑒定結(jié)果Tab.2 Genus level identification results of microorganism strains isolated from drug manufacturing process |
|
|
表 3 藥品生產(chǎn)過程主要污染微生物種水平鑒定結(jié)果Tab.3 Species level identification results of microorganism strains isolated from drug manufacturing process |
241株污染微生物中來自無菌原料生產(chǎn)區(qū)129株，無菌制劑生產(chǎn)區(qū)112株。2個生產(chǎn)區(qū)域污染微生物的種群多樣性分析結(jié)果如圖 1所示，表明10個屬的微生物占到了原料生產(chǎn)區(qū)和制劑生產(chǎn)區(qū)污染微生物的80%。2個生產(chǎn)區(qū)域中葡萄球菌都是污染最嚴重的微生物，其次是微球菌。在不同生產(chǎn)區(qū)域都存在特定的污染微生物種類，如芽孢桿菌、不動桿菌和鞘氨醇單胞菌僅在無菌原料生產(chǎn)區(qū)域檢測到，而類芽孢桿菌、戈登氏菌和斯科曼氏球菌則主要存在于無菌制劑生產(chǎn)區(qū)。無菌原料生產(chǎn)區(qū)和無菌制劑生產(chǎn)區(qū)不同監(jiān)控項目中污染微生物的種群結(jié)構顯示，葡萄球菌和微球菌廣泛存在于多個監(jiān)控項目中。在無菌原料生產(chǎn)區(qū)的B級潔凈區(qū)域分離到63株微生物，而無菌制劑生產(chǎn)區(qū)的B級潔凈區(qū)域僅分離出8株微生物。芽孢桿菌主要存在于無菌原料生產(chǎn)區(qū)的活性炭材料中，而不動桿菌則主要存在于注射用水中。A級潔凈區(qū)域污染的微生物主要包括葡萄球菌、微球菌和類芽孢桿菌等。
|
A.無菌原料生產(chǎn)區(qū)（raw material production area）B.無菌制劑生產(chǎn)區(qū)（sterile preparation production area）圖 1 藥品生產(chǎn)過程中不同監(jiān)控項目污染微生物種群多樣性分析（橫坐標指每個監(jiān)控項目中不同屬細菌數(shù)量占這個監(jiān)控項目總細菌數(shù)量的百分比）Fig.1 Bacterial population diversity analysis of different monitoring area in drug manufacturing process (The abscissa refers to the percentage of each genus strain number in the total number of this monitoring project) |
葡萄球菌是藥品生產(chǎn)過程的主要污染微生物，本研究共分離到97株葡萄球菌，占到全部污染微生物的40.3%，分布于10個不同的葡萄球菌種，如表 4所示。其中，科氏葡萄球菌污染最嚴重，檢測分離到33株，其次是表皮葡萄球菌（27.8%）、人葡萄球菌（10.3%）、溶血葡萄球菌（6.19%）。
|
|
表 4 藥品生產(chǎn)過程污染葡萄球菌的種群多樣性分析Tab.4 Diversity analysis Staphylococcus strains isolated from drug manufacturing process |
本研究對示范企業(yè)無菌藥品生產(chǎn)工藝和廠區(qū)布局調(diào)研后，建立了包含原輔料、包裝材料、生產(chǎn)人員、生產(chǎn)環(huán)境、制藥用水和藥品微生物檢測實驗室等項目的監(jiān)控程序。監(jiān)控結(jié)果顯示，生產(chǎn)環(huán)境中污染微生物的分離率最高，占全部污染微生物的72.6%。值得關注的是，A級潔凈區(qū)分離到30株微生物，表明無菌藥品終產(chǎn)品具有很高的微生物污染風險，提示企業(yè)需啟動微生物數(shù)據(jù)偏差（MDD）調(diào)查。目前多數(shù)藥品生產(chǎn)企業(yè)往往只針對核心生產(chǎn)區(qū)域A/B級進行微生物監(jiān)控，而忽略了其他區(qū)域和環(huán)節(jié)微生物污染的風險。前期研究表明，藥品終產(chǎn)品中污染微生物可來自于原輔料[9-10]、配料間和洗瓶[11]、生產(chǎn)人員[12]等。本研究結(jié)果顯示，原輔料、生產(chǎn)人員、制藥用水中也都監(jiān)測到微生物污染，存在污染藥品終產(chǎn)品的風險，企業(yè)應加強相關項目的微生物監(jiān)控和風險評估。
4.2 過程污染微生物的鑒定分析基因型鑒定方法如16S rRNA序列比對方法、細菌DNA特征序列鑒定法等，比生化表型鑒定方法更加穩(wěn)定可靠，已逐漸成為細菌鑒定的主要技術手段[13-14]。本研究采用基于16S rRNA序列比對等方法對藥品生產(chǎn)過程監(jiān)控微生物進行了鑒定，共發(fā)現(xiàn)44個屬，95個種，表明藥品生產(chǎn)過程污染微生物種類繁雜，對微生物鑒定技術提出了更高要求。與前期研究[15]一致，本研究基于16S rRNA序列比對方法能夠?qū)崿F(xiàn)大多數(shù)細菌的準確鑒定。但任何單一的微生物鑒定方法都不能實現(xiàn)所有微生物菌株的準確鑒定，16S rRNA序列比對方法能夠給出準確的屬水平鑒定結(jié)果，但部分菌種如頭狀葡萄球菌和山羊葡萄球菌不能準確鑒定到種[16]。因此，本研究結(jié)合VITEK生化鑒定系統(tǒng)及MALDITOF MS質(zhì)譜方法，能夠?qū)崿F(xiàn)全部污染微生物的種水平準確鑒定。此外，基于16S rRNA序列便于建立標準化的核酸信息數(shù)據(jù)庫，能夠基于16S rRNA序列的親緣聚類分析有效監(jiān)控生產(chǎn)過程污染微生物的遺傳進化，為藥品生產(chǎn)過程污染微生物的風險評估提供依據(jù)。
4.3 生產(chǎn)人員的帶菌污染分析研究表明，制藥企業(yè)生產(chǎn)環(huán)境中污染微生物大部分都是由人員帶入[17-18]。本研究與前期研究結(jié)果一致，藥品生產(chǎn)環(huán)境中污染的微生物，以人源攜帶微生物為主，如葡萄球菌、微球菌等，表明生產(chǎn)人員是環(huán)境微生物負載的主要來源。因此，企業(yè)應加強生產(chǎn)人員的衛(wèi)生培訓和無菌操作意識，生產(chǎn)人員的規(guī)范操作是企業(yè)實現(xiàn)藥品生產(chǎn)過程污染微生物有效控制的關鍵。A級潔凈區(qū)污染的微生物主要包括葡萄球菌、微球菌、類芽孢桿菌等，也都屬于人源攜帶微生物。A級潔凈區(qū)污染微生物具有極大污染藥品終產(chǎn)品的風險，因此，嚴格控制生產(chǎn)人員的帶菌、控制人員流動是保障A級潔凈區(qū)域微生物控制的關鍵。
4.4 無菌藥品生產(chǎn)線微生物分布地圖的建設藥品企業(yè)廠區(qū)微生物分布地圖是指通過對藥品生產(chǎn)過程監(jiān)控收集的污染微生物進行鑒定，基于微生物監(jiān)控的歷史數(shù)據(jù)，從污染微生物種屬信息和引入來源等方面進行分析，獲取藥品生產(chǎn)過程特定區(qū)域污染微生物的分布規(guī)律。建立藥品企業(yè)廠區(qū)污染微生物分布地圖是追溯產(chǎn)品污染微生物來源的有效方法，也是藥品生產(chǎn)過程消毒劑選擇的重要依據(jù)。同時能夠指導生產(chǎn)車間制定有效的微生物控制措施，降低微生物負荷，提高無菌保障水平，使企業(yè)的質(zhì)量管理和無菌保障更加完善。本研究發(fā)現(xiàn)，一些微生物種群的分布具有明顯的特異性，如芽孢桿菌主要存在于活性炭材料中，而不動桿菌則主要存在于注射用水中。因此，藥品企業(yè)非常有必要建立全面的廠區(qū)微生物分布地圖，根據(jù)污染微生物的種群分布的特異性，更好指導藥品生產(chǎn)過程污染微生物的溯源分析調(diào)查。
無菌藥品生產(chǎn)企業(yè)過程污染微生物菌株庫的建立及數(shù)據(jù)分析
藥物分析雜志 2019, Vol. 39 Issue (11): 1954-1960. DOI: 10.16155/j.0254-1793.2019.11.05
參考文獻
| [1] |
EISSA ME. Quantitative microbial risk assessment of pharmaceutical products[J]. PDA J Pharm Sci Technol, 2017, 71(3): 245. DOI:10.5731/pdajpst.2016.007047
|
| [2] |
姚瑜嬪, 陳永法, 邵蓉. 藥害事件頻發(fā)原因分析及防范對策[J]. 上海醫(yī)藥, 2008, 29(4): 160.
YAO YB, CHEN YF, SHAO R. Analysis on the causes of frequent drug injurg events and prevention methods[J]. Shanghai Med Pharm J, 2008, 29(4): 160. DOI:10.3969/j.issn.1006-1533.2008.04.006 |
| [3] |
高志峰, 姚蕾. 淺談藥害事件發(fā)生的原因與防范[J]. 藥品評價, 2012, 9(17): 42.
GAO ZF, YAO L. Discussion on the causes and prevention of drug emergency[J]. Drug Eval, 2012, 9(17): 42. DOI:10.3969/j.issn.1672-2809.2012.17.009 |
| [4] |
李瓊瓊, 宋明輝, 秦峰, 等. 制藥企業(yè)生產(chǎn)環(huán)境中污染葡萄球菌菌種鑒定方法的比較評價及毒素基因調(diào)查分析[J]. 中國醫(yī)藥工業(yè)雜志, 2019, 50(4): 416.
LI QQ, SONG MH, QIN F, et al. Species identification analysis by different methods and toxin genes detection of Staphylococcus strains isolated from drug manufacturing enterprises[J]. Chin J Pharm, 2019, 50(4): 416. |
| [5] |
胡昌勤. 藥品微生物控制現(xiàn)狀與展望[J]. 中國藥學雜志, 2015, 50(20): 1747.
HU CQ. Current situation and trend in pharmaceutical microbial control[J]. Chin Pharm J, 2015, 50(20): 1747. DOI:10.11669/cpj.2015.20.003 |
| [6] |
戶美玲, 陳佩, 嚴東珍, 等. 建立潔凈區(qū)微生物數(shù)據(jù)庫與無菌藥品GMP生產(chǎn)過程控制的探討[J]. 微生物學免疫學進展, 2013, 41(3): 33.
HU ML, CHEN P, YAN DZ, et al. Study on establishing a microorganism database of clean oreas and GMP manufacturing process-control for sterile medicinal products[J]. Prog Microbiol Immunol, 2013, 41(3): 33. DOI:10.3969/j.issn.1005-5673.2013.03.007 |
| [7] |
宋明輝, 李瓊瓊, 馮震, 等. 葡萄球菌屬不同靶基因序列種水平鑒定能力的比較評價研究[J]. 藥物分析雜志, 2018, 38(4): 672.
SONG MH, LI QQ, FENG Z, et al. Evaluation on molecular identification capacity of different target gene sequences for Staphylococcus species[J]. Chin J Pharm Anal, 2018, 38(4): 672. |
| [8] |
KIM M, OH HS, PARK SC, et al. Towards a taxonomic coherence between average nucleotide identity and 16S rRNA gene sequence similarity for species demarcation of prokaryotes[J]. Int J Syst Evol Microbiol, 2014, 64(2): 346.
|
| [9] |
丁勃, 劉艷, 孫銅, 等. 中藥口服液微生物污染溯源分析及污染風險的評價與控制[J]. 中國醫(yī)藥工業(yè)雜志, 2016, 47(10): 1311.
DING B, LIU Y, SUN T, et al. Traceable analysis of microbial contamination to traditional chinese medicine oral liquid and its evaluation and control[J]. Chin J Pharm, 2016, 47(10): 1311. |
| [10] |
劉鵬, 戰(zhàn)宏利, 嚴倩倩, 等. 中成藥口服給藥制劑及其原料藥微生物污染相關性分析[J]. 藥物分析雜志, 2014, 34(6): 1068.
LIU P, ZHAN HL, YAN QQ, et al. Analysis of the correlation of microbial contamination of oral preparations of Chinese patent medicine and crude drugs[J]. Chin J Pharm Anal, 2014, 34(6): 1068. |
| [11] |
范一靈, 房蕊, 蔣波, 等. 微生物鑒定分型技術應用于醫(yī)藥企業(yè)微生物污染調(diào)查[J]. 中國醫(yī)藥工業(yè)雜志, 2010, 41(11): 810.
FAN YL, FANG R, JIANG B, et al. Application of identification and characterization methods for microbial contamination survey in pharmaceutical industry[J]. Chin J Pharm, 2010, 41(11): 810. DOI:10.3969/j.issn.1001-8255.2010.11.006 |
| [12] |
陳偉盛, 關倩明, 朱榮峰, 等. 藥品微生物限度檢查中微生物污染的鑒定和溯源分析[J]. 藥物分析雜志, 2014, 34(1): 58.
CHEN WS, GUAN QM, ZHU RF, et al. Identification and characterization of bacterial contaminations isolated by microbial limit test[J]. Chin J Pharm Anal, 2014, 34(1): 58. |
| [13] |
STAMATOSKI B, ILIEVSKA M, BABUNOVSKA H, et al. Optimized genotyping method for identification of bacterial contaminants in pharmaceutical industry[J]. Acta Pharm, 2016, 66(2): 89.
|
| [14] |
張國林, 蘇遠科, 沈海英, 等. 16S rRNA/ITS基因序列分析與微生物分類鑒定及其在藥品微生物質(zhì)量控制中的應用[J]. 中國現(xiàn)代應用藥學, 2017, 34(10): 129.
ZHANG GL, SHU YK, SHEN HY, et al. Application of 16S rRNA/ITS sequencing and analysis in the identification, classification of microbial and drug quality control[J]. Chin J Mod Appl Pharm, 2017, 34(10): 129. |
| [15] |
朱詩應, 戚中田. 16S rDNA擴增及測序在細菌鑒定與分類中的應用[J]. 微生物與感染, 2013, 8(2): 104.
ZHU SY, QI ZT. Application of bacterial 16S rDNA amplication and sequencing in the classification and identification of bacteria[J]. J Microb Infect, 2013, 8(2): 104. |
| [16] |
SHAH MM, IIHARA H, NODA M, et al. dnaJ gene sequence-based assay for species identification and phylogenetic grouping in the genus Staphylococcus[J]. Int J Syst Evol Microbiol, 2007, 57(Pt 1): 25.
|
| [17] |
范一靈, 馮震, 鐘瑋, 等. 無菌藥品生產(chǎn)企業(yè)核心區(qū)微生物污染調(diào)查與分析[J]. 中國藥事, 2014, 28(6): 586.
FANG YL, FENG Z, ZHONG W, et al. Investigation and analysis of microbiological contamination in core area of sterile drug manufacturing enterprises[J]. Chin Pharm Aff, 2014, 28(6): 586. |
| [18] |
胡立榮, 歐陽波, 曉柯. 中藥制劑生產(chǎn)中的微生物污染途徑及控制[J]. 中國藥事, 2015, 29(6): 613.
HU LR, OUYANG B, XIAO K. Microbial contamination routes in production of traditional Chinese medicine preparations and its controls[J]. Chin Pharm Aff, 2015, 29(6): 613. |
無菌藥品生產(chǎn)企業(yè)過程污染微生物菌株庫的建立及數(shù)據(jù)分析
藥物分析雜志 2019, Vol. 39 Issue (11): 1954-1960. DOI: 10.16155/j.0254-1793.2019.11.05
南京肽業(yè)生物科技有限公司
地址：
江蘇省南京市化學工業(yè)園區(qū)方水路158號三樓
Email: info@njpeptide.com
總機：025-58361106-801
傳真：025-58361107-806
