3CLPro是冠狀病毒復制所必須的酶 可作為有效的抗病毒藥物靶點
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3CLPro是冠狀病毒復制所必須的酶，可作為有效的抗病毒藥物靶點，2003年SARS以來已經有大量的研究基礎。Lopinavir與Ritonavir等抗HIV藥物也是作用于類似的蛋白酶靶點，并在臨床上得到很好的驗證。由于人體內沒有與3CLPro類似切割位點的蛋白酶，可篩選出高特異性的抑制劑，具有更好的安全性。3CLPro在beta冠狀病毒中保守性高，篩選出的3CLPro抑制劑具有廣譜抗冠狀病毒能力，甚至可能用于豬冠狀病毒等其他動物的疾病治療中。
3CLPro是冠狀病毒復制所必須的酶 可作為有效的抗病毒藥物靶點
3CLPro是新型冠狀病毒（2019-nCoV, SARS-CoV-2）產生的主要的蛋白酶，冠狀病毒大多數功能蛋白（非結構蛋白）由ORF1ab基因編碼，先翻譯成一個多蛋白體（7096aa），再由3CLPro切割成多個有活性的蛋白如病毒復制蛋白RdRp。此外，該蛋白可能切割胞內蛋白NEMO從而抑制干擾素信號途徑的活化。因此抑制3CLPro能夠有效抑制病毒的感染與復制。▲3CLPro在ORF1ab編碼的多蛋白體上有11個切點(Thanigaimalai Pillaiyar)2019-nCoV與SARS-CoV的3CLPro只差12個氨基酸，同源性大于96%，兩者結構基本一致（見下圖）。3CLPro 識別位點依賴于P1位的Gln。迄今為止沒有發(fā)現人體內識別Gln的蛋白酶，研究者推測該酶的抑制劑可能有更好的安全性。
▲3CLPro蛋白質結構(Linlin Zhang)
這次疫情中使用的抗HIV藥物洛匹那韋（lopinavir）和利托那韋（ritonavir）最早設計用來抑制HIV蛋白酶。2003年SARS期間United Christian醫(yī)院C M Chu等用于41例SARS治療，患者死亡率只有2.4%。比較此前的常規(guī)治療過111個非典患者死亡率為28.8%有明顯的治療效果。后來SARS結束，研究沒能繼續(xù)下去。由于新冠病毒3CLPro與SARS-CoV高度同源，這次疫情中這兩種抑制劑被寄予厚望，迅速成為網紅。表一：在中國臨床實驗注冊中心注冊的洛匹那韋（lopinavir）和利托那韋（ritonavir）臨床研究值得注意的是，雖然Lopinavir與Ritonavir最早在SARS和MERS治療中表現出一定的有效性，在新冠肺炎治療上的有效性仍需謹慎樂觀。HIV蛋白酶屬于天冬氨酸蛋白酶家族，而冠狀病毒蛋白酶為絲氨酸蛋白酶家族，且HIV蛋白酶抑制劑專門針對HIV蛋白酶二聚體口袋優(yōu)化（見下圖左），這個口袋在冠狀病毒蛋白酶中并不存在，Nukoolkarn等人通過軟對接分析認為兩個小分子結合到3CLPpro底物結合位點（下圖右紅色圓圈，筆者沒查到實驗證據，如有歡迎留言）。該藥物對HIV蛋白酶的抑制活性為1.3 pM(Ki)，對3CLPro抑制活性為15uM(Ki)，體外對SARS病毒的活性濃度分別為4ug/ml和50ug/ml。
由于這次病毒潛伏期長，傳染源不明確，專家預測新型冠狀病毒可能像流感一樣長期與人類共存。2003年以來，研究者針對SARS-CoV、MERS-CoV和這次的2019-nCoV 3CLPro抑制劑做了大量研究工作，在這些工作的基礎上尋找更有效的新冠治療藥物不僅僅是當務之急，也是應對人類可能面對的未來風險的必須努力。表二：在clinical trials上注冊的3CLPro其他抑制劑臨床研究疫情以來，基于3CLPro結構有多篇文章通過計算機模擬虛擬篩選了可能用于新冠肺炎治療的藥物，除上述Lopinavir與Ritonavir外，Kwok-Yin Wong等人通過結構模擬從已經上市的藥物中篩選了16個潛在的抗2019-nCoV藥物，其中NS5A抑制劑ledipasvir（雷地帕韋） 和velpatasvir（維帕他韋）副作用小，Epclusa (velpatasvir / sofosbuvir（索氟布韋）) and Harvoni (ledipasvir / sofosbuvir)也許有更好的抑制效果。Chen Lingling等人基于3CLPro篩選了32297種潛在的抗病毒藥用植物化合物并發(fā)現9種可能優(yōu)化后用于抗COVID-19的治療效果。Alessandro Contini從3118個FDA已經批準上市的藥物中通過虛擬篩選，鑒定出Indinavir、Lopinavir and Atazanavir及Cobicistat（原靶點: CYP3A）等多個潛在的藥物。Arun K. Shanker研究了Aza-Peptide Epoxide (APE)作為起始結構的可能。Jared S.Morse等人提示化合物3CLPro-1可以在nM水平上抑制SARS和MERS 病毒3CLPro活性，可能對2019-nCoV 3CLPro有效。Zhijian Xu等認為奈非那韋Nelfinavir可能跟3CLPro結合。
▲Jared S.Morse推薦的針對SARS-CoV 3CLPro抑制劑。
A-C: Lead vinylsulfone protease inhibitors; D: 已有人體數據的3CLPro-1; E-F:在FIPV上驗證的3CLPro抑制劑，GC376對SARS-CoV 3CLPro IC50=4.35uM, CC50>150uM, 有很好的安全性。
▲可能抑制3CLPro的幾種已上市藥物計算機模擬篩選結果（Kwok-Yin Wong）
過去二十年中，人類遭遇三次beta冠狀病毒的襲擊，雖然SARS-CoV神秘的消失了，基于COVID-19全球蔓延的趨勢，而MERS病毒至今沒有被控制，開發(fā)一種廣譜的抗冠狀病毒藥物成為關系到人類安全的重要任務。由于3CLPro在SARS、MERS病毒和2019-nCoV中高度保守，人類在HIV蛋白酶抑制劑上的成功經驗，3CLPro是廣譜抗冠狀病毒藥物的有效靶點。
有趣的是，雖然3CLPro與HIV蛋白酶結構差異非常大，計算機模擬篩選的很多藥物為HIV蛋白酶抑制劑?；诩兓?CLPro蛋白的酶活性驗證和結構驗證是2019-nCoV蛋白酶抑制劑篩選的重要手段。此外，3CLPro通過切割Dabcyl-KTSAVLQSGFRKME-Edans檢測靈敏度高，很容易建立高通量篩選體系。
▲Zhang Linlin等人報導的α-酮酰胺類3CLPro抑制劑。針對2019-nCoV的化合物11b抑制3CLPro IC50=0.67uM，并可在類似水平上抑制SARS與MERS。
綜上所述，雖然SARS以來科學家在尋找抗冠狀病毒藥物上斷斷續(xù)續(xù)做了一些努力，目前尚無抗新型冠狀病毒的特效藥物，只能進行支持治療，依賴患者自愈。但是新型冠狀病毒已經形成全球蔓延趨勢，截止目前已經在全球29個國家確診78000多例。目前COVID-19與MERS還沒有得到有效的控制，人們必須對其他冠狀病毒保持時刻警惕。此外，由于中間宿主不明確、新型冠狀病毒潛伏期長，且存在無癥狀感染等原因，專家推測新型冠狀病毒很可能會跟流感一樣與人類長期共存。特別希望引起注意的是，這次疫情在武漢地區(qū)集中爆發(fā)，我們擔心新型冠狀病毒可能已經傳播到周圍的其他物種并作為傳染源潛伏下來。因此我們認為開發(fā)針對3CLPro抑制劑的冠狀病毒治療藥物有非常重要的價值與意義。
▲1918年西班牙大流感三次爆發(fā)與死亡率（Ali Ekici）。流感第一波在1918年7月達到高峰，然后病死率下降到接近0。到10月，流感再次爆發(fā)，病亡率最高接近2.5%。次年2月，流感再次爆發(fā)，感染之前沒被感染過的人（Wilbur Chen）
特別感謝廣東省實驗動物監(jiān)測所提供N蛋白質粒。感謝中科院上海巴斯德研究所錢志康教授、浙江大學黃耀偉教授、復旦大學黃強教授的指導與支持。感謝所有客戶的支持，讓我們有擔當的勇氣與力量。
1. Alessandro Contini. Virtual screening of an FDA approved drugs database on tow COVID-19 coronavirus proteins.2. Arun K. Shanker, et.al. Analysis of Whole Genome Sequences and Homology Modelling of a 3C Like Peptidase.3. C M Chu, et.al. Role of lopinavir/ritonavir in the treatment of SARS: initial virological and clinical findings.4. Jared S. Morse, et.al. Learning from the Past: Possible Urgent Prevention and Treatment Options for Severe Acute Respiratory Infections Caused by 2019-nCoV.5. Ling-Ling Chen. Structural basis of SARS-CoV-2 3CLpro and anti-COVID-19 drug discovery from medicinal plants.6. Linlin Zhang, et.al. Alpha-ketoamides as broad-spectrum inhibitors of coronavirus and enterovirus Replication.7. Linlin Zhang, et.al. X-ray Structure of Main Protease of the Novel Coronavirus SARS-CoV-2 Enables Design of α-Ketoamide Inhibitors.8. Samantha Zinnia Fernandes, et.al. Crystallization fo SARS Coronavirus 3CL protease to identify Inhibitor Targets.9. Si Chen, et.al. Feline Infectious Peritonitis Virus Nsp5 Inhibits Type I Interferon Production by Cleaving NEMO at Multiple Sites.10. Thanigaimalai Pillaiyar,et.al. Recent discovery and development of inhibitors targeting coronaviruses.11. Veena Nukoolkarn. et.al. Molecular dynamic simulations analysis of ritronavir and lopinavir as SARS-CoV 3CLpro inhibitors.12. Xin Liu, et.al. Potential inhibitorsfor2019-nCoV coronavirus M protease from clinically approved medicines.13. Zhijian Xu, et.al. Nelfinavir was predicted to be a potential inhibitor of 2019-nCov main protease by an integrative approach combining homology modelling, molecular docking and binding free energy calculation.
3CLPro是冠狀病毒復制所必須的酶 可作為有效的抗病毒藥物靶點
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